Вы здесь

Пренатальная диагностика патологии плода

Введение

Пренатальная диагностика нарушений, которые могут оказать влияние на развитие плода, приобретает все большее значение в свете усовершенствования методик получения и анализа проб амниотической жидкости и крови плода. В настоящей главе дается краткое описание основных диагностических процедур для выявления биохимических, цитогенетических, гематологических, иммунологических и микробиологических нарушений.

Методики получения плодного материала

Амниоскопия. Получение проб амниотической жидкости относительно просто при минимальной частоте осложнений. Исследование амниотической жидкости имеет ценность в I триместре беременности; в ней проводится биохимическое определение альфа-фетопротеина и цитогенетический анализ клеток. В более поздние сроки беременности число жизнеспособных клеток в амниотической жидкости уменьшается, и следовательно, культуры, пригодные, например, для хромосомного анализа, вырастить гораздо труднее. При сроке примерно в 30 нед определение в амниотической жидкости величины отношения Л/С (лецитин/сфингомиелин), а также содержания билирубина и креатинина дает дополнительную диагностическую информацию о ряде нарушений.

Применение фетоскопии



Фетоскопия. Метод фетоскопии получил распространение недавно и используется для аспирации проб крови плода из плаценты или пуповины в месте ее прикрепления к плаценте. Основные цели стетоскопического исследования представлены в табл. 6. Помимо использования в качестве метода для непосредственного осмотра частей тела плода, оно позволяет брать его кровь для диагностики ряда гематологических и биохимических нарушений. Метод позволяет получать для исследования и другие ткани (кожу, волосы, мышцы).

Плацентоцентез. Пункция плаценты вслепую или аспирация крови плода из плаценты. Этот метод применялся до введения в практику фетоскопии. Он до сих пор иногда используется при отсутствии надлежащих средств для фетоскопии, однако частота осложнений при нем выше, чем при фетоскопии.

Трансцервикальная аспирация ворсин хориона. В последнее время культивирование клеток, взятых из ворсин хориона в ранние сроки беременности (8—12 нед), позволило проводить цитогенетическое исследование и изучение ДНК в самом начале беременности.

Показания к пренатальной диагностике

Показания к пренатальной диагностике

В большой степени виды нарушений, подлежащих антенатальной диагностике, и контингент беременных, направляемых на исследование, определяются наличием средств и оборудования. Хотя повсеместно признан факт повышения риска хромосомных нарушений по мере увеличения возраста матери, последний, считающийся показанием к проведению исследования, колеблется в широких пределах (от 35 до 40 лет) в зависимости от возможностей медицинского учреждения. Диагностика менее распространенных метаболических нарушений обычно проводится в специализированных лабораториях, куда направляются пробы амниотической жидкости. Диагностика гематологических изменений требует более или менее чистого образца крови плода, что до недавнего времени было сдерживающим фактором. Возможно, методика рекомбинации ДНК устранит необходимость работы с чистой пробой гемоглобина и соответствующую диагностику можно будет проводить на культурах клеток амниотической жидкости или трофобласта. Диагностика гемофилии зависит от наличия чистой плазмы крови плода, а также лабораторных средств для определения свертывающей активности фактора VIII.

В табл. 7 обобщены виды нарушений, которые могут быть диагностированы пренатально с помощью исследования амниотической жидкости (АЖ), клеток АЖ или крови плода.

Альфа-фетопротеин

Альфа-фетопротеин (α-ФП) играет важную роль во внутриутробной диагностике пороков развития нервной трубки плода (ГТРНТ), а также служит маркером для выявления и ведения некоторых форм рака (печеночно-клеточный и опухоли из зародышевых клеток). В данном разделе обсуждается клиническое применение определения α-ФП в амниотической жидкости и сыворотке крови с указанием применяемых методик.

Введение

Незначительные количества α-ФП (менее 10 мкг/л), продуцируемого печенью, определяются в сыворотке крови у здоровых небеременных взрослых женщин. Уровень α-ФП в крови увеличивается по мере развития беременности и достигает пика (менее 500 мкг/л) в 38 нед. Появление α-ФП в крови матери обычно является результатом транссудации белков амниотической жидкости (АЖ.) через плацентарный барьер и, следовательно, имеет плодовое происхождение. У плода α-ФП синтезируется первоначально желточным мешком; однако при сроке в 30 дней беременности основным местом синтеза становится печень. Концентрация α-ФП в сыворотке крови плода повышается до максимальных значений (до 3 г/л) в 12—14 нед беременности, затем его уровень постепенно снижается вплоть до конца беременности. Содержание, характерное для взрослого человека, достигается через 20 месяцев после рождения. Интересно отметить, что максимальная концентрация α-ФП в жидких средах плода и амниотической жидкости не коррелирует с его пиками в сыворотке крови матери (табл. 8). Это является следствием изменений структуры плаценты в процессе развития беременности. Плацента человека становится более проницаемой во вторую половину беременности, что приводит к увеличению перехода α-ФП из амниотической жидкости. Соотношение концентраций α-ФП в сыворотке крови плода, амниотической жидкости и сыворотке крови матери составляет приблизительно 30 000 : 200: 1.

Содержание α-ФП в сыворотке крови матери и амниотической жидкости

α-ФП сходен с альбумином по последовательности расположения элементов и размеру аминокислотной молекулы; его молекулярная масса равна примерно 65000. При электрофорезе он мигрирует в район сл. В отличие от альбумина α-ФП — гликопротеид, содержащий 3—4% углеводов. Вследствие различий в углеводной части α-ФП отличается микрогетерогенностью и может подразделяться на субфакдии по изоэлектриче-ским точкам (pJ 4,8 и 5,2) и по сродству к конканавалину А и лентил-лектину при связывании. Биологическая роль α-ФП пока неясна. Имеющиеся в настоящее время гипотезы связывают а-ФП с транспортной функцией аналогично альбумину или отводят ему роль в подавлении иммунного реагирования между организмами матери и плода.

Альфа-фетопротеин амниотической жидкости

Физиологическая беременность. Уровень α-ФП в амниотической жидкости колеблется в зависимости от срока беременности параллельно изменениям концентрации в сыворотке крови плода. Максимальные значения (<35мг/л) имеют место в 12—14нед беременности с постепенным снижением к 20 нед и более быстрым падением в дальнейшем. Источником α-ФП в амниотической жидкости является моча плода.

Пороки развития нервной трубки плода (ПРНТ). В тех случаях, когда пороки развития нервной трубки связаны с дефектом развития костной и кожной ткани над ней, просачивание белков сыворотки или спинномозговой жидкости от плода в амниотическую жидкость приводит к повышению уровня α-ФП. При отсутствии свода черепа при анэнцефалии содержание α-ФП значительно повышено; однако при spina bifida дефект костного покрытия спинного мозга приводит к тому, что уровень α-ФП только на 3—8 стандартных отклонений (СО) превышает средний уровень для данных сроков беременности.

В некоторых случаях spina bifida (10%) костный дефект покрыт толстым слоем кожи, предотвращающим просачивание. При этих «закрытых» ПРНТ содержание α-ФП в амниотической жидкости находится в допустимых пределах. При анэнцефалии плода в поздние сроки беременности обычно обнаруживается многоводие. Высказывалось предположение, что плод обычно заглатывает АЖ, которая абсорбируется в кровь плода. Поскольку при анэнцефалии у плода часто отсутствует механизм глотания, в поздние сроки беременности объем АЖ бывает увеличен. В тех случаях, когда повышение уровня α-ФП в АЖ сомнительно (3 СО<х>5 СО), рекомендуются дальнейшие исследования. К нему относится изучение субфракций α-ФП, наблюдение быстро прилипающих клеток в культуре, определение повышенного уровня ацетилхолинэстеразы в АЖ и ультразвуковое исследование.

Иммунофлюоресцентное окрашивание гемоглобина плода (F-клеток)

Ложные результаты. Ошибка в сроке беременности более чем на 3 нед часто может привести к получению ложноположи-тельных или ложноотрицательных результатов. В тех случаях, когда время последней менструации вызывает сомнения, точные данные о сроке беременности можно получить с помощью ультразвукового исследования. Ложноположительные результаты бывают следствием «загрязнения» пробы АЖ кровью плода при амниоцентезе. Наличие крови можно проверить путем обнаружения гемоглобина плода (HbF) с помощью электрофореза или методом его флюоресцентной локализации, а также определением эритроцитов плода (тест Kleihauer) (рис. 9). Внутриутробная гибель или тяжелый дистресс плода часто связаны с повышением уровня а-ФП в АЖ, возможно, в результате просачивания сыворотки крови плода в АЖ. В таких случаях АЖ обычно приобретает грязный оттенок в результате контаминации эритроцитами и продуцирования метгемоглобина; обычно это сопровождается определенными клиническими симптомами и подтверждается низкой экскрецией эстрогенов.

Ложноотрицательные результаты могут иметь место, когда жидкость по ошибке получена не из амниотического, а из мочевого пузыря. Загрязнение мочой подтверждается определением содержания креатинина. К сожалению, ценность определения α-ФП в диагностике ПРНТ снижается при сроках беременности более 20 нед. Как при физиологической беременности, так и при беременности, осложненной ПРНТ, уровень α-ФП в АЖ после 20 нед значительно снижается, уменьшается также и степень его повышения при ПРНТ по сравнению с нормой. Наличие многоводия еще более усложняет диагностику в поздние сроки беременности.

Субфракции α-ФП. Современными исследованиями характера субфракций α-ФП в АЖ выявлены различия между нормальной беременностью и беременностью, осложненной ПРНТ. На основании различной способности к связыванию с конканавалином-А (кон-А) определяются два типа α-ФП — тип А, который связывается, и тип Б, не обладающий этой способностью. При нормальной беременности в амниотической жидкости тип Б по отношению к суммарному α-ФП составляет в среднем около 40% в 14 нед беременности и снижается до 12% к 20 нед. В сыворотке крови плода величина отношения типа Б к общему содержанию составляет приблизительно 10%; непосредственное просачивание α-ФП из участка поражения нервной трубки приводит к снижению этой величины в АЖ. При сомнительном повышении уровня α-ФП дифференцировать беременность, осложненную ПРНТ, от нормальной можно с помощью определения величины отношений субфракций. Следует помнить, что попадание в АЖ крови плода может привести к ложноположительным результатам. Кроме того, при сроках более 20 нед отмечается некоторое совпадение параметров, свойственных нормальной беременности, с таковыми при наличии ПРНТ.

Прочие врожденные нарушения. С повышением уровня α-ФП связан и ряд других врожденных нарушений, кроме ПРНТ. К ним относятся такие хромосомные аберрации, как синдром Тернера (45X0) и врожденный нефроз.

Альфа-фетопротеин сыворотки крови

Во время беременности определение α-ФП в сыворотке крови используется в антенатальной диагностике врожденных пороков и при определении тактики ведения беременности. Будучи онкофетальным белком, α-ФП служит также ценным маркером для выявления некоторых видов рака и наблюдения за больными.

Сыворотка крови матери

Антенатальная диагностика ПРНТ. В общей популяции частота ПРНТ составляет приблизительно 2 : 1000 родов, причем частота анэнцефалии и spina bifida в отдельности равна 1 : 1000. При наличии в анамнезе рождения первого ребенка с ПРНТ вероятность рождения второго ребенка с ПРНТ составляет 5%. При рождении двух детей с подобным пороком развития она возрастает до 13%. Многие программы массового обследования с определением α-ФП только в АЖ предусматривают наблюдение лишь за этой «группой риска». Однако более 90% детей с ПРНТ рождаются у матерей, не имевших в анамнезе рождения детей с этим пороком. Определение уровня α-ФП в сыворотке крови матери при сроке беременности 16—18 нед дает возможность выявить анэнцефалию в 88%, spina bifida — в 54% случаев. Взятие сыворотки крови у матери является простой процедурой, не представляющей опасности для плода. Основная проблема программ массового обследования на основании сыворотки крови матери заключается в том, что повышение уровня α-ФП в сыворотке крови наблюдается при многих состояниях. К ним относятся многоплодная беременность, внутриутробная смерть плода, угрожающий выкидыш и резус-конфликтная беременность, а также диабет и патология печени у беременной. Кроме того, повышение содержания α-ФП у матери может быть вызвано плодово-материнским кровотечением, развивающимся самопроизвольно либо в результате амниоцентеза. Случаи кажущегося повышения уровня α-ФП в результате ошибочного определения срока беременности обычно исключаются ультразвуковым исследованием.

Беременность, сопровождающаяся высоким риском. Содержание α-ФП в сыворотке крови матери обычно зависит от двух факторов: концентрации α-ФП в АЖ и изменений проницаемости плаценты. Осложнения беременности, сопровождающиеся изменением целости плаценты (кровотечение, дистресс плода, угрожающий выкидыш), ведут к повышению уровня α-ФП в сыворотке крови беременной. Подобным же образом при беременности, осложненной резус-изоиммунизацией и диабетом, связанное с этими состояниями увеличение площади поверхности плаценты приводит к повышению уровня α-ФП в сыворотке. В качестве биохимического показателя этих осложнений определение α-ФП может рассматриваться только как вспомогательный тест в дополнение к таким более надежным методам, как определение содержания эстрогенов, плацентарного лактогена и хорионического гонадотропина.

При трофобластической болезни уровень таких плацентарных белков, как ХГ, значительно повышен, в то время как белки плода, например, α-ФП, отсутствуют. Следовательно, определение уровня а-ФП может иметь ценность в том случае, когда диагноз пузырного заноса или хориокарциномы вызывает сомнения, а содержание ХГ находится в пределах нормы.

Субфракции α-ФП в сыворотке крови беременной. После исключения всех случаев ошибочного срока и осложнений беременности остается все же большая группа женщин (не менее 40%), которые при повышенном уровне α-ФП в сыворотке крови рожают нормальных детей. Эта ситуация остается серьезной проблемой программ массового обследования с использованием сыворотки крови матери. Повышение уровня α-ФП в сыворотке крови беременной может быть обусловлено самопроизвольным или искусственно вызванным плодово-материнским кровотечением (ПМК). Попадание крови плода в кровоток матери легко выявляется положительной реакцией Клейхауэра. Однако при транссудации АЖ в сыворотку крови матери для подтверждения диагноза кроветечения нет простого теста. Относительные количества субфракций α-ФП в сыворотке крови плода отличаются от таковых в АЖ. Проведенные в последнее время исследования динамики α-ФП в сыворотке крови беременной методом хроматографии на Кон-А-агарозе позволили определить, имеет ли место повышение уровня α-ФП вследствие искусственно вызванного ПМК плодового происхождения или связано с АЖ. Анализ гетерогенности α-ФП в сыворотке крови беременной, возможно, позволит дифференцировать нормальную беременность от беременности плодом с ПРНТ.

Оценка степени зрелости легких плода

Незрелость легких плода является основной причиной гибели недоношенного новорожденного. Как показали исследования последних лет, во время беременности в околоплодных водах появляется сурфактант, количество и качество которого определяется его продуцированием в легком. Сурфактант способствует поддержанию стабильного низкого поверхностного натяжения на границе между воздухом и жидкостью в альвеолах. Благодаря сурфактанту снижается та величина давления, которая необходима для растяжения легкого и предотвращения спадения альвеол. Респираторный дистресс-синдром (РДС) приводит к гибели новорожденного чаще, чем любая другая болезнь. Это нарушение определяется отсутствием легочного сурфактанта. В отсутствие нужных количеств сурфактанта затрудняется газообмен, развивается гипоксия, повышается сопротивление легочных сосудов, развивается гипоперфузия легкого. Постепенно образуются гиалиновые мембраны, состоящие из некротизированной альвеолярной ткани, эритроцитов и фибрина.

Сурфактант представляет собой сложную смесь липидов, белков и углеводов. В зрелом легком фосфолипиды составляют 90—95% от общего содержания, а липиды и фосфатидил-холин (лецитин) — 50—80% от фосфолипидной фракции (рис. 10). Фосфатидилхолин имеет биполярную химическую конфигурацию в гидрофильной холиновой группе и две боковые цепи гидрофобной насыщенной жирной кислоты. Другим важным компонентом является фосфатидилглицерин; он составляет 7—14% общего содержания фосфолипидов. В зрелом легком встречаются также и такие менее важные компоненты, как фосфатидилинозитол, фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин, фосфатидилсерин и лизолицетин.

Структура лецитина

Синтез фосфатидилхолина в легком плода может осуществляться двумя путями. Более 90% сурфактантного лецитина образуется путем включения холина (рис. 11). Холин фосфорилируется и затем превращается в CDP-холин. Фермент холинфосфотрансфераза катализирует реакцию, которая превращает CDP-холин в диглицерид, дающий фосфатидилхолин. Метилирование как другой путь биосинтеза вносит небольшой вклад в общее содержание лецитина (рис. 10). В этом процессе фосфатидилэтаноламин подвергается последовательному метилированию и образует фосфатидилхолин; диглицериды 1 : 2 являются предшественниками синтеза лецитина, фосфатидил-глицерина и фосфатидилинозитола. Эти соединения образуются в результате гидролизного расщепления фосфатидиловой кислоты.

Биосинтез лецитина

После 35—36 нед беременности наблюдается быстрое повышение активности на основном пути биосинтеза и связанное с ним повышение уровня лецитина в амниотической жидкости. Фосфолипидный сурфактант локализуется в основном в альвеолярных клетках II типа. Он накапливается в ламеллярных тельцах, откуда выделяется в альвеолы и переносится в амниотическую полость вместе с легочной жидкостью. Фосфати-дилглицерин синтезируется в микросомах альвеолярных клеток II типа.

Перед плановым родовозбуждением или кесаревым сечением необходимо точно определить степень зрелости плода. Многие из имеющихся клинических методик оценки течения беременности зачастую дают неточные результаты и могут привести к неправильной клинической оценке степени зрелости плода.

Количественное определение легочного сурфактанта

Отношение Л/С. Уровень лецитина в амниотической жидкости значительно повышается приблизительно в 35 нед беременности, в то время как содержание сфингомиелина не изменяется (рис. 12).

Динамика содержания лецитина и сфингомиелина во время беременности

Сфингомиелин используется в качестве внутреннего стандарта для измерения относительного повышения уровня лецитина во время беременности. До 31—32 нед беременности концентрация сфингомиелина в амниотической жидкости превышает концентрацию лецитина. Затем содержание последнего стремительно возрастает до самых родов, и, по данным Королевского женского госпиталя, величина отношения Л/С, равная или превышающая 2:1, указывает на зрелость легких плода у 99% беременных женщин, не страдающих диабетом (рис. 13).

Динамика величины отношения лецитин/сфингомиелин (Л/С) во время беременности

При отношении, равном 1,5—1,9: 1, примерно в 50% случаев можно ожидать развития РДС. При отношении ниже 1,5:1 риск последующего развития РДС повышается до 75%. На достоверность величины отношения Л/С оказывает влияние ряд факторов:

  • 1.    При взятии амниотической жидкости из сектора, расположенного около рта плода, величина отношения Л/С бывает выше (до 0,7: 1), чем в среднем в амниотической жидкости.
  • 2.    Пробы амниотической жидкости, «загрязненные» кровью или меконием, лучше не анализировать, поскольку оба эти компонента содержат лецитин и сфингомиелин, влияние которых на величину Л/С непредсказуемо.
  • 3.    Определение отношения Л/С задолго до родов снижает прогностическую ценность теста.
  • 4.    На результат может повлиять способ обработки пробы после ее взятия. Если величину отношения Л/С не определяют сразу после взятия пробы, амниотическую жидкость следует заморозить до — 20 °С с целью предотвращения воздействия фосфолипаз. Кроме того, центрифугирование при скоростях, превышающих 3000 оборотов (необходимое для удаления клеточных остатков), приводит к снижению величины Л/С, а слишком малые скорости (менее 100 оборотов) обусловливают повышение этого показателя.

Следует помнить, что РДС может развиться и в результате действия других факторов, кроме дефицита сурфактанта. Имеются сообщения, что у многих детей с тяжелой формой гемолитической болезни РДС развивается даже при нормальном соотношении Л/С. Асфиксия при рождении также часто приводит к развитию РДС в неонатальном периоде, несмотря на то, что перед родами величина отношения Л/С может превышать 2:1. По этой причине определение других сурфактантов амниотической жидкости, а именно фосфатидилэтаноламина (ФЭ), фосфатидилглицерина (ФГ) и фосфатидилинозитола (ФИ), может дать дополнительную информацию.

ФИ появляется в водах при сроке в 26—30 нед беременности; его содержание увеличивается параллельно росту величины Л/С до 35—36 нед, затем уменьшается. ФГ появляется в водах в 35 нед, его уровень стремительно возрастает между 37-й и 40-й нед беременности. По последним данным, при наличии ФГ и величины Л/С, указывающей на зрелость легких плода, РДС не развивается, несмотря на асфиксию и гемолитическую болезнь. ФГ определяют и у некоторых детей с величиной Л/С ниже 2:1. Это сочетание отмечается при так называемом «ускоренном» созревании легких плода в случаях тяжелой гипер-тензии беременных, длительного безводного промежутка и сахарного диабета.

О значимости определения отношения Л/С при диабете до сих пор существуют различные мнения. Одни авторы считают, что оно является слишком ненадежным показателем, не оправдывающим риск, связанный с проведением амниоцентеза. По данным других исследователей, ложноположительные результаты составляют лишь 3% при величине Л/С, равной или превышающей 2:1. Возможно, это противоречие связано с различием применяемых лабораторных методик. Однако более вероятно, что оно обусловлено гипергликемией и гиперинсулинемией плода, характерными для беременности, осложненной диабетом, которые изменяют характер синтеза легочного сурфактанта. Гиперинсулинемия может противодействовать влиянию кортизола на созревание легких, замедляя развитие клеток II типа и уменьшая продуцирование лецитина.

Другие варианты определения лецитина

Дипальмитоиллецитин представляет собой основной лецитин сурфактанта в зрелых легких, из чего следует, что концентрация пальмитиновой кислоты в амниотической жидкости достоверно повышается после 34 нед беременности и хорошо коррелирует с величиной Л/С. Оценивали также значение отношения уровня пальмитиновой кислоты к стеариновой (отношение ПК/СК). Оно стремительно возрастает в 35—36 недель беременности, достигая величины, превышающей 4,5:1. Средние значения отношения ПК/СК в амниотической жидкости беременных с диабетом лучше коррелируют с исходом для новорож денного, чем величина Л/С (рис. 14).

Динамика величины отношения пальмитиновая кислота/стеариновая кислота в амниотической жидкости при неосложненной беременности и у беременных, больных диабетом

Другие методы определения функции сурфактанта

Пенный тест. Это быстрая лабораторная процедура, основанная на способности легочного сурфактанта образовывать стабильную пену в присутствии этанола. Этанол представляет собой непенящийся конкурентный сурфактант, который устраняет из пены белки, соли желчных и свободных жирных кислот. При концентрации этанола в 47,5% стабильные пузырьки пены после встряхивания обусловлены лецитином амниотической жидкости.

При получении полного кольца из пузырьков по мениску в амниотической жидкости, разведенной в отношении 1 : 2, РДС у новорожденного наблюдается редко. Согласно имеющимся данным, вероятность ошибки при отрицательном результате теста выше, чем при положительном. На обе группы результатов может влиять «загрязнение» амниотической жидкости в том смысле, что физические параметры стабильности пены изменяются под действием присутствующих в водах остатков клеток и кровяных телец.

Помутнение амниотической жидкости. Определение оптической плотности свежей пробы амниотической жидкости при длине волны 650 им используется для оценки степени помутнения амниотической жидкости, которое, как полагают, зависит от общей ее концентрации. Оптическая плотность, равная или превышающая 0,15, хорошо коррелирует с величиной Л/С, свойственной зрелым легким.

Определение содержания мочевины, мочевой кислоты и креатинина в амниотической жидкости

В отличие от уровня мочевины и мочевой кислоты повышение содержания креатинина в амниотической жидкости по мере развития беременности носит почти линейный характер. Эти данные согласуются с изменениями функции почек у развивающегося плода. Прогрессирующее созревание клубочков способствует фильтрации мочевины, мочевой кислоты и креатинина, но по мере установления функции канальцев часть мочевины и мочевой кислоты реабсорбируется. Напротив, креатинин реабсорбции не подвергается. Уровень креатинина в амниотической жидкости хорошо коррелирует с величиной Л/С на протяжении всей беременности; последнее, равное 2:1, соответствует уровню креатинина в 0,15 ммоль/л.

Гормональные показатели

Кортикостероиды. Кортизол, очевидно, играет важную роль в созревании легких плода. Легкие плода человека содержат специфические глюкокортикоидные рецепторы, и повышенный уровень кортизола в амниотической жидкости часто, хотя и не всегда, соответствует величине Л/С, характерной для зрелых легких, п повышенной концентрации пальмитиновой кислоты. При беременности, осложненной диабетом, повышение содержания кортизола в амниотической жидкости, обычно наблюдаемое при сроке 35 нед, иногда задерживается или отсутствует, и концентрация кортизола снижена. В настоящее время она имеет ограниченную ценность в качестве единственного показателя степени зрелости легких плода.

Пролактин. Предполагается, что пролактин стимулирует синтез пальмитиновой кислоты в клетках II типа. Низкий уровень пролактина в крови пуповины действительно коррелирует с последующим развитием РДС, в то время как при высоких концентрациях пролактина в пуповинной крови РДС встречается крайне редко.

Тиреоидные гормоны. Небольшое число исследований свидетельствуют, что у новорожденных с РДС достоверно снижена концентрация трийодтиронина и тироксина в крови пуповины. По данным одной из новейших работ, интраамниальное введение тироксина ускорило созревание плода у восьми беременных.

Зрелость легких при патологических состояниях

Ускорение или замедление развития легких может быть обусловлено некоторыми патологическими состояниями беременности. В этих случаях возникает несоответствие между стадией развития легких плода и хронологическими сроками беременности. При такой беременности может иметь место задержка или активация созревания легких.

Активация созревания легких отмечена при беременности, осложненной следующими состояниями:

  • 1. гипертензивными нарушениями почечного или сердечно-сосудистого генеза или вследствие тяжелого токсикоза беременных; 
  • 2. гемоглобинопатиями; 
  • 3. сахарным диабетом (типы D, Е, F, R); 
  • 4. хориоамнионитом; 
  • 5. плацентарной недостаточностью; 
  • 6. преждевременным излитием вод.

При всех указанных патологических состояниях ситуация стресса вызывает усиленный синтез эндогенных глюкокортикоидов, которые повышают активность ферментов, необходимых для синтеза сурфактанта.

Задержка созревания легких может быть вызвана

  • 1. водянкой плода; 
  • 2. сахарным диабетом (типы А, В и С).

Доказано, что инсулин блокирует образование лецитина, возможно, путем стимуляции и активизации фермента фосфодиэстеразы, что ведет к снижению уровня цАМФ, необходимого для синтеза лецитина. Однако и другие вероятные факторы, кроме инсулина, принимают при диабете участие в синтезе сурфактанта.

Другие методы определения сурфактанта в амниотической жидкости

Определение микровязкости (флюоресцентная поляризация)

В работах последних лет упоминается применение флюоресцентного углеводородного детектора для определения микровязкости амниотической жидкости. При этом исследовании 1,6-ди-фенил-1,3,5-гексатриен детектора при режиме в 365 нм поляризует падающие лучи в водной среде, излучая свет при длине волны свыше 418 нм. Результаты этих работ дают основание предположить, что такая методика поможет точно прогнозировать состояние новорожденного и вероятность развития РДС.

При смешивании с амниотической жидкостью вещество с детектора внедряется на углеводородном участке в двойной липидный слой (липосомы) присутствующих в ней фосфолипидов. Степень вращения в этой гидрофобной среде зависит от микровязкости липосомного окружения. Чем выше вязкость, тем эффективнее липосома противостоит вращению молекул детектора. Ограниченное вращение детектора приводит к деполяризации падающего света, степень которой можно измерить с помощью специального поляриметра, который в настоящее время появился в продаже под названием «Анализатор степени зрелости легких плода».

Быстрое снижение вязкости примерно после 36 нед указывает на наличие поверхностно-активных фосфолипидов. В первых исследованиях по этой методике показано, что она является отличным индикатором отношения Л/С при искусственной дисперсии и использовании искусственно созданных концентраций дипальмитоила-фосфатидилхолина и сфингомиелина. Последующие работы указали, что фосфатидилглицерин, фосфати-дилсерин и фосфатидилинозитол в физиологических концентрациях также изменяют микровязкость.

В работе Gold и Mosley (1980) 149 проб амниотической жидкости, взятых не более чем за 48 ч до родов, были подвергнуты исследованию методом микровнскозиметрии, точность прогноза состояния новорожденного и вероятности развития РДС составила 100%.

При использовании этого метода на результаты не влияет объем анализируемой амниотической жидкости, но оказывает воздействие «загрязнение» кровью или меконием в связи с тем, что липиды последних увеличивают вязкость липосом. Второй источник ошибок — центрифугирование перед исследованием.

Гипербарическая жидкостная хроматография

В последние годы гипербарическая жидкостная хроматография (ГБЖХ) достигла такой степени разработки, что стало возможным точно анализировать различный биологический материал, представляющий интерес для клинициста, в течение нескольких минут, а не нескольких часов, как при традиционном анализе методом тонкослойной хроматографии. В литературе пока нет описания клинического испытания на большом материале, где бы состояние новорожденных сопоставлялось с результатами исследования содержания фосфолипидов в амниотической жидкости методом ГБЖХ. Методика, разработанная в нашем госпитале, позволяет отделять, помимо лецитина (Л) и сфингомие-лина, фосфатидилглицерин (ФГ), фосфатидилинозитол (ФИ), фосфатидилсерин (ФСС) и фосфатидилэтаноламин (ФЭ) менее чем за 25 мин. На рис. 15 и 16 представлены репрезентативные хроматографические данные выделения фосфолипидов из проб амниотической жидкости, взятой у одной и той же беременной до и после наступления зрелости легких плода.



Определение степени зрелости легких плода методом гипербарической жидкостной хроматографии (ГПЖХ), дающей низкие уровни лецитина до наступления зрелости легких

Исследование методом ГПЖХ амниотической жидкости при наличии зрелого плода

Заключение

Самой главной способностью новорожденного является осуществление акта дыхания, и открытие того факта, что сурфак-тант переходит из альвеол через развивающиеся воздухоносные пути в амниотическую жидкость, привело к разработке методов биохимического и биофизического анализа, которые, как показывает практика, дают полезную в клиническом отношении информацию при условии соблюдения всех средовых и технических требований и устранения посторонних влияний.

На развитие легочного сурфактанта могут оказать влияние многие физиологические, генетические и экологические факторы, не получившие пока объяснения. Этими факторами обусловливаются индивидуальные колебания, ведущие к ложноположи-тельным и ложноотрицательным результатам, без которых не обходится ни одно исследование.

Пренатальная диагностика гемоглобинопатий

Разработка методов исследования ДНК и получения крови от плода означает, что такие гемоглобинопатии, как гомозиготная талассемия, серповидно-клеточная анемия и гемоглобинзависимая водянка плода (болезнь Барта), могут быть выявлены у плода в 18—20 нед беременности.

Исследование ДНК

Гемоглобинопатии в результате утраты глобинового гена (включая δβ-талассемию и некоторые формы α-талассемии) могут быть выявлены с помощью исследования ДНК. Для этого требуется получить из амниотической жидкости фибробласты в 16 нед беременности. Клетки культивируют, получают ДНК. и изучают ее на предмет утраты генов путем определения способности ДНК к гибридизации с пробным материалом, содержащим определенную последовательность генов, причем снижение этой способности указывает на наличие утраты глобинового гена. Альтернативный вариант исследования предусматривает расщепление ДНК на сегменты ограничивающей эндонуклеазой (вид ДНК-расщепляющего фермента) и изучение методом электрофореза, при котором определенное расположение фрагментов ДНК отражает наличие или отсутствие определенных глобиновых генов.

С помощью исследования ДНК можно диагностировать некоторые случаи серповидно-клеточной анемии и гомозиготной β-талассемии. При этих нарушениях β-глобиновый ген не изменен. Однако на участках действия некоторых ограничивающих эндонуклеаз наблюдается полиморфизм, ряд вариантов которого связывают с генами, несущими аномалии β-глобина. Таким образом, характер расположения фрагментов после обработки ДНК определенными эндонуклеазами можно использовать для диагностики β-глобиновых аномалий. Однако характер полиморфизма различается в различных популяциях, и исследование ДНК, возможно, имеет ограниченную ценность для антенатальной диагностики β-глобиновых гемоглобинопатий.

Взятие крови у плода

В начале 70-х годов были разработаны методы взятия крови у плода с помощью фетоскопии и аспирации плаценты. Получение крови путем фетоскопии обычно осуществляется в 17—18 нед беременности при местном обезболивании. Для этого применяют инструмент под названием «фетоскоп», состоящий из троакара, канюли, иглоскопа и источника света с волоконной оптикой (рис. 17).

Инструменты для взятия проб у плода (фетоскоп)

Локализация плода и плаценты определяется с помощью ультразвукового сканирования. В норме плацента должна быть прикреплена на задней или боковой стенке матки. Прикрепление плаценты на передней стенке может препятствовать введению фетоскопа и затруднять осмотр плацентарных сосудов. Троакар, канюлю и иглоскоп вводят через брюшную стенку в плодный пузырь. При осмотре находят сосуды на поверхности плаценты, после чего по канюле проводят тонкую иглу. Из сосуда забирают примерно 50 мкл плодной крови.

Пробы, в которые может попасть материнская кровь из плаценты, затем исследуют на предмет содержания плодовых клеток. Для этой цели применяют электронный измеритель размеров частиц, способный отличать большие клетки плода от более мелких материнских.

Плацентарная аспирация представляет собой альтернативный метод получения крови плода. Он заключается во введении иглы в плаценту и аспирировании при ее постепенном выведении. Эта процедура обычно дает худшие по качеству порбы и сопровождается повышением частоты осложнений.

Исследование темпов синтеза глобиновой цепи

Эритроциты инкубируют с меченой аминокислотой ([3Н] -лейцин), которая включается во вновь синтезируемые глобиновые цепи. Эти цепи выделяют методом ионообменной хроматографии и определяют темпы синтеза α-, β- и γ-глобиновых цепей. Типичная хроматограмма, полученная у нормального плода в 18 нед беременности, представлены на рис. 18. Выраженное снижение темпов синтеза β-глобина наблюдается при гомозиготной β-талассемии. Снижение величины отношения синтеза β/α и β/γ характерно для талассемии. Для гомозиготного плода типична величина β/α и β/γ менее 0,035 (т. е. синтез цепи β<3,5%). В норме величина отношения β/α более 0,08, а β/γ более 0,12. Обычно с уверенностью отличить гетерозиготную малую талассемию от нормы невозможно. Этот метод может быть использован для диагностики других форм гемоглобинопатии. У детей с α-талассемией отмечается относительное снижение синтеза α-глобина, а на серповидно-клеточную анемию указывает отсутствие синтеза βА и наличие синтеза βS.

В некоторых случаях лучшие пробы, полученные с помощью фетоскопии, оказываются с примесью материнской крови. Если в пробе содержится до 60% материнских клеток, можно сделать поправку на синтез глобина в крови матери. Пробы с более высоким процентным содержанием материнских клеток обычно обрабатывают методом их избирательного гемолиза (реакция Orskov — Jacobs — Stewart) с целью обогащения клетками плода.

Синтез глобина в пробах крови, полученной с помощью фетоскопии у плодов, составляющих группу риска развития гомозиготной β-талассемии

Диагностика гемофилии методом фетоскопического исследования в ранние сроки беременности

Фактор VIII можно рассматривать как состоящий из трех связанных между собой, но отдельных компонентов. К ним относятся

  • 1) антиген, связанный с фактором VIII (VIIIAT), 
  • 2) свертывающая активность фактора VIII (VIIIC), 
  • 3) кофактор ристоцетина (VIIIP).

В крови новорожденного VIIIC находится в концентрации, сравнимой с таковой у взрослого организма. Концентрация VIIIP в крови пуповины несколько превышает его уровень в крови взрослого. Фактор VIIIC не переходит через плацентарный барьер, так что имеющийся уровень отражает синтез фактора VIII плодом. В околоплодных водах этот фактор отсутствует.

Выявление фактора VIIIC с целью пренатальной диагностики гемофилии стало возможным в последние годы благодаря разработке методик получения чистой крови плода из сосудов пуповины во время фетоскопии при сроках около 18 нед беременности, а также развитию нового иммунорадиометрического исследования фактора VIIIC, т. е. метода выявления антигена, специфического для свертывающей активности фактора VIII и отличного от антигена фактора VIII. Для этой цели следует брать чистую пробу центрифугированной крови, без малейших примесей, что представляет значительные технические трудности. Однако, несмотря на это, пренатальная диагностика гемофилии у беременных, составляющих группу риска развития этой патологии, в настоящее время стала осуществима.

Осложнения фетоскопии

В центрах, имеющих надлежащее оборудование для проведения этого вмешательства, частота осложнений невысока при условии, что выполняется оно с достаточным вниманием и осторожностью при использовании ультразвукового исследования в масштабе реального времени для локализации плаценты и введения троакара.

К осложнениям относятся:

  • а) получение недостаточного количества крови и необходимость повторной фетоскопии; 
  • б) смешивание крови плода с кровью матери (определяется методом Клейхауэра) или с помощью прибора, анализирующего размер эритроцитов и отличающего эритроциты плода от эритроцитов матери на основании их большего объема — средний клеточный объем (СКО) эритроцитов плода составляет около 140 фл, а СКО материнских эритроцитов обычно колеблется от 80 до 96 фл и снижается до 65—70 фл при тенденции к β-талассемии. Такие пробы пригодны для диагностики талласемии, но не могут быть использованы для выявления гемофилии; 
  • в) кровотечение из плаценты или пуповины; 
  • г) травматизация плода троакаром или канюлей — хороший ультразвуковой контроль уменьшает эту вероятность; 
  • д) кровотечение из брюшной стенки; 
  • е) подтекание амниотической жидкости; 
  • ж) потеря плода, которая может наблюдаться непосредственно после фетоскопии или через некоторое время после нее и регистрируется как преждевременное рождение.  Как показывают данные Всемирного Реестра по перинатальной диагностике талассемии за 1980 г., потеря плода имеет место не более чем в 7% случаев сразу после операции и не более чем в 4% случаев в виде преждевременного рождения. Эти показатели улучшаются по мере накопления опыта у оперирующего врача; 
  • з) инфицирование организма матери, плода или полости амниона.

С лабораторной точки зрения к затруднению при постановке точного диагноза ведут следующие причины:

  • а) недостаточное количество крови, 
  • б) нечистая проба, содержащая слишком большое количество материнских клеток или амниотической жидкости. Для концентрирования эритроцитов можно использовать метод концентрации, предложенный Orskov, 
  • в) в случае талассемии пограничные варианты р-синтеза дают сомнительную картину.

Цнтогенетика в клинической практике

Цнтогенетические исследования для выявления хромосомных аномалий являются неотъемлемой частью таких двух направлений, как лечение бесплодия и перинатология. Врачи, практикующие в этих областях, в определенной степени знакомы с наиболее распространенными показаниями к проведению хромосомного исследования. Этот раздел задуман как обзор современного состояния тех аспектов цитогенетических исследований, которые имеют непосредственное отношение к работе в данных областях. Фенотипические различия, или внешние морфологические характеристики — и как вариант нормы (например, цвет волос), и как патологическое отклонение (например, гипертензия), — можно рассматривать через призму четырех этиологических категорий.

  • 1.    Полигенные (многофакторные) нарушения, наступающие отчасти в результате кумулятивного действия нескольких генов или многих аллелей на одном локусе.
  • 2.    Аномальные гены в одном генетическом локусе (менделевские нарушения), ведущие к аномалиям минимум у 1% детей, родившихся живыми.
  • 3.    Тератогенные нарушения, возникающие в первую очередь в результате вредных воздействий внешней среды.
  • 4.    Хромосомные нарушения в результате изменения количества и структуры хромосом. Эти нарушения поражают около 0,5% детей, родившихся живыми (табл. 9). В настоящем разделе будет рассмотрена именно эта четвертая категория.

Механизмы анеуплоидии

В соматических тканях хромосомы человека визуализируются лучше всего на той стадии клеточного цикла, которая называется метафазой митоза. В 1956 г. было установлено, что кариотип человека насчитывает 46 хромосом, т. е. 22 пары аутосом и 2 половые хромосомы (46, XX, ♀; 46, XY, ♂). Вскоре после этого было показано, что болезнь Дауна, синдром Эдвардса и синдром Бартолина — Патау связаны с наличием лишней хромосомы (21, 18 и 13 соответственно, т. е. трисомией 21, 18 и 13), а синдромы Тернера и Клайнфелтера связаны с недостающей (у женщин) и лишней (у мужчин) Х-хромосомой, т. е. 45, X и 47, XXY. Это стало очевидно, поскольку появилась возможность располагать хромосомы человека по их внешней форме и размеру.

Применение авторадиографии (т. е. радиоактивного мечения ДНК) дало возможность однозначано идентифицировать большее количество этих хромосом по характеру репликации (характеру мечения), чем было возможно раньше только по морфологическим признакам (с 8 пар их число возросло до 18). Выяснилось, что 0,5% новорожденных имеют серьезные хромосомные дефекты, которые в целом носят случайный характер и примерно наполовину представляют собой дефекты половой хромосомы. Они оказывают невыраженное влияние на фенотип, которое врачи часто принимают за вариант нормы. Вторая половина — аутосомные дефекты, ведущие к тяжелым поражениям: задержке роста или умственного развития, множественным врожденным порокам и часто смерти в раннем возрасте.

Начиная с 1970 г. разработка различных методов окрашивания полосами (banding) привела к тому, что усовершенствование анализа кариотипа человека пошло стремительными темпами. Эти методики дифференциального окрашивания позволяют однозначно определять и группировать по парам все хромосомы, так что в настоящее время возможно с точностью определить утрату или прибавление Целой хромосомы или ее части и выявить перестройку во взаимном расположении хромосом. Предел разрешающей способности метода определяется шириной образующихся полос и в конечном счете пределом разрешающей способности оптического микроскопа.

Наиболее распространенным методом, применяемым при цитогенетическом исследовании, является окрашивание по Гимзе (G-окрашивание). Для получения этой видимой дифференциальной картины используются различные методики, но объединяет их конечная избирательная потеря какого-либо белка из хромосом перед окрашиванием (рис. 19).

Хромосомный анализ методом окрашивания по Гимзе (46,XY)

К прочим методам окрашивания, имеющим специальное применение, относятся: окрашивание квинакрином (Q-окрашивание) — флюоресцентная краска с помощью ультрафиолетовых лучей выявляет оттенки интенсивности, дает картину, сходную р таковой при G-окрашивании.

Обратное окрашивание (R-окрашивание) — картина, обратная таковой при G- и Q-окрашивании, применяется для выявления терминальных перестроек.

Центромерное окрашивание (С-окрашивание) — избирательное окрашивание центромерного гетерохроматина, применяется для определения гетерохроматических вариантов (полиморфизмов).

Репликационное окрашивание. В последнее время импульсное включение бромодеоксиуридина в активно делящиеся клетки в фазу репликации клеточного цикла используется для получения рисунков репликации. Они в принципе сходны с таковыми при G- и R-окрашивании, где используются более традиционные методики. Преимущество этого метода заключается в немедленной дифференциации гетерохроматина, репликация которого происходит позже (рис. 20).

Хромосомный анализ методом репликационного окрашивания (46,XY)

Большинство серьезных аутосомных дефектов возникают de novo. Их влияние на фенотип очевидно уже в первый месяц эмбриогенеза; эффективная терапия здесь невозможна. Однако совершенно очевидно, что некоторые серьезные хромосомные пороки находятся в зависимости от возраста матери. Подсчитано, что, если женщины старше 35 лет воздержатся от деторождения, частота этих пороков снизится примерно на 1/3—1/2.

Получение достаточного для исследования количества нужных клеток (т. е. клеток в метафазу митоза) требует, в частности, культивирования проб, полученных в асептических условиях, в искусственной среде до тех пор, пока клетки не размножатся до нужного количества. Культуры клеток обычно подразделяются на два класса:

  • 1. Кратковременные суспензии. К ним относятся культуры лейкоцитов периферической крови, которые выращивают в течение 2—3 дней.
  • 2. Длительные однослойные культуры фибробластов. К ним относятся продукты зачатия, ткани плодного яйца при самопроизвольном аборте, трупные ткани, а также клетки плода, получаемые при амниоцентезе. При культивировании этого материала результаты получают через 2—4 нед.

Гепаринизированные пробы крови для хромосомного исследования обычно берут в следующих обстоятельствах:

  • 1.    У новорожденных, имеющих такую совокупность клинических признаков (или фенотип), которая не соответствует никаким известным врожденным или наследственным нарушениям, но указывает на вероятность хромосомной аномалии, например, трисомии 21.
  • 2.    В таких случаях бесплодия, как первичная аменорея, или при бесплодном браке, когда супруги прошли развернутое обследование с отрицательными результатами.
  • 3.    У супругов, имеющих в анамнезе привычные и самопроизвольные выкидыши, при отсутствии прочих очевидных причин.
  • 4.    По показаниям трупную кровь успешно куьтивируют даже через двое суток после гибели.

Длительные культуры фибробластов выращивают из проб, которые берут при следующих патологических состояниях.

  • 1.    Ткани при самопроизвольном аборте или диагностическом выскабливании в тех случаях имеющихся в анамнезе привычных выкидышей или анэмбрионии, когда прочие возможные причины исключены.
  • 2.    Плод, мертворожденный или недавно умерший новорожденный с таким сочетанием клинических характеристик (фенотипом), которое не исключает хромосомной аномалии.
  • 3.    Любой самопроизвольный аборт, развивающийся после амниоцентеза (см. ниже), для подтверждения первоначального цитогенетического результата.
  • 4.    Кожные биоптаты для подтверждения степени мозаицизма, установленной в культуре лейкоцитов периферической крови.
  • 5.    Материал, полученный путем амниоцентеза, для пренатальной диагностики хромосомных нарушений, пороков развития нервной трубки и некоторых биохимических нарушений.

Показания к амниоцентезу

  • 1.    Возраст матери. В нашем госпитале проведение амниоцентеза рекомендуется всем женщинам старше 37 лет. В 37—39 лет риск рождения живого ребенка с хромосомной аномалией составляет около 1%, в 40-44 года — 2%, после 45 лет — более 3%
  • 2.    Рождение в прошлом ребенка с болезнью Дауна или другой аутосомной трисомией; риск составляет около 1%.
  • 3.    Пороки развития нервной трубки — рождение в прошлом ребенка со spina bifida, анэнцефалией, мозговой грыжей или другими формами спинальной дистрофии, включая spina bifida occulta, связано с риском, равным 4—5%; такая же степень риска имеется, если одно из этих состояний отмечено у одного из родителей; в семьях с несколькими подобными случаями риск повышается; исследование может быть показано в некоторых семьях с иным семейным анамнезом этих состояний. (Spina bifida occulta с поражением только 1—2 сегментов не является показанием к исследованию.)
  • 4.    Состояния, сцепленные с полом: определение пола плода бывает полезно в тех случаях, в которых патология пока еще не может быть диагностирована с помощью специальных тестов.
  • 5.    В семьях с хромосомными транслокациями анализ следует проводить после надлежащего обследования.
  • 6.    Любые врожденные нарушения метаболизма поддаются диагностике, но для этого требуется очень тщательное исследование.
  • 7.    Талассемия и гемоглобинопатии: некоторые случаи могут быть диагностированы путем исследования ДНК из амниотической жидкости. Возможно, вскоре с помощью этого метода будут диагностировать и другие болезни (см. раздел «Исследование ДНК»).
  • 8.    В случаях выявления пороков развития при ультразвуковом исследовании. Типичным примером является анэнцефалия, но представляется потенциально возможной и диагностика агенезии почек, деформации конечностей, костных дисплазий и некоторых других состояний.

Организация цитогенетической службы

В идеале назначение на пренатальную диагностику должно обсуждаться и планироваться до зачатия или в самые ранние сроки беременности.

  • 1.    Все пробы амниотической жидкости направляются в специализированные лаборатории по вышеперечисленным показаниям.
  • 2.    Всех женщин, кому, вероятно, показан амниоцентез по поводу зарегистрированных в семье хромосомных транслокаций, врожденных нарушений метаболизма, сцепленных с полом состояний и т. д., следует направлять в генетическую клинику специализированных больниц на диагностическое обследование с определением степени риска повторного развития аномалии и проведением специальных анализов. Чрезвычайно важно, чтобы женщины получали эти направления до наступления беременности или в самые ранние ее сроки, так как на исследования, которые необходимо провести до амниоцентеза, могут уйти многие недели.

Определение уровня α-ФП в супернатанте амниотической жидкости обычно занимает несколько дней. Хромосомные исследования и биохимический анализ ферментных нарушений занимают, как правило, 2—4 нед в зависимости от темпов роста первичных культур.

Если при выявлении патологии родители решают прервать беременность, очень важно получить материал для повторного цитогенетического или биохимического исследования с целью подтверждения пренатального диагноза, а также для выращивания большого количества клеток с их последующим замораживанием и хранением в жидком азоте. Это особенно важно при необычных, уникальных аномалиях. Установлено, что после искусственно вызванных или пролонгированных родов плацента при создании стерильных условий представляет собой лучший источник живых клеток, чем плод.

Иногда врачи назначают два анализа, не требующих культивирования тканей, — анализ Х-хроматина или полового хроматина (тельца Барра) и Y-хроматина (Y-телец). Обычно они проводятся в мазках, взятых из полости рта, но можно использовать и влагалищные мазки, а также клетки амниотической жидкости. Быстрота определения строения половой хромосомы, однако, не компенсирует ненадежности этого метода из-за ряда технических причин. Поэтому предпочтение следует отдавать направлению крови на кариотипирование или — в случае исследования плодовых клеток — ждать окончательных результатов цитогенетического анализа.

В настоящее время стало возможным определение различий в количестве гетерохроматина (в целом функционально неактивной ДНК). С-окрашивание помогает увидеть эти участки положительного окрашивания около центромеров на длинном плече хромосом 1, 9 и 16. Они различны по размеру или составляют часть перицентрических инверсий. Другие типы полиморфизма затрагивают участки центромеров на хромосомах 3, 4 и 13, а иногда сателлитные участки и нити всех акроцентрических хромосом. Эти участки также различаются по размеру и свойствам окрашивания. Дистальный сегмент длинного плеча Y-хромосомы также бывает различным. Варианты полиморфизма передаются по наследству и не изменяются из клетки в клетку, из поколения в поколение. Они считаются вариантами нормы. Делались попытки установить корреляционную связь между этими вариантами и индивидуальным фенотипом, но без особого успеха. Удалось продемонстрировать некоторую связь с бесплодием, продукцией несбалансированных гамет и сниженным коэффициентом умственных способностей. Эти данные пока не подтверждены.

Однако полиморфизм гетерохроматина можно использовать в качестве маркера для цитологической дифференциации членов гомологичной пары хромосом, а также для различения нормальных кариотипов двух разных людей. Эти различия имеют несколько вариантов применения в генеалогических исследованиях.

  • 1.    Возможность цитологического отделения материнских клеток от клеток плода женского пола в культуре амниотической жидкости или плодного материала, когда есть вероятность примеси материнских клеток.
  • 2.    Выяснение зиготности близнецов с помощью этих хромосомных маркеров.
  • 3.    В случаях трисомии определение происхождения (от матери или от отца) и стадии нерасхождения хромосом (например, хромосомы 21), которые могут быть полиморфными. Некоторые данные указывают на то, что до 25% случаев болезни Дауна у детей, рожденных живыми, может быть вызвано отцовским нерасхождением, а не материнским, как считалось раньше. Далее триплоидия, которая обычно обнаруживается у плодов при самопроизвольном выкидыше, чаще всего является результатом двойного оплодотворения одной яйцеклетки.
  • 4. С помощью этих вариантов возможно исследование сцеплений с известными генами.

Совершенно ясно, что конкретные фенотипы в результате любой определенной хромосомной аномалии должны отражать отсутствие или избыток определенных генов на участках, охваченных хромосомной аномалией. В кариотипе человека известно расположение по меньшей мере 300 аутосомных генов, а также более 100 генов, расположенных на Х-хромосоме. Может быть, в будущем появится возможность использовать пучки («кластеры») тесно сцепленных генов либо для демонстрации наличия хромосомного изменения, слишком мелкого для выявления цитологическим исследованием, либо для выяснения точек разрыва.

Если ген обнаруживается около полиморфного участка, генеалогические исследования, возможно, помогут определить, на каком именно члене гомологичной пары хромосом находится определенный аномальный ген. Это может найти применение в пренатальной диагностике состояний, не выраженных в культуре, или при определении доминантных генов, которые проявляются в разное время в более позднем возрасте. Пока такие связи не установлены. В то же время все больше и больше взрослых оказываются носителями сбалансированных хромосомных перестроек (или транслокадий); передачу по наследству их несбалансированных форм можно предотвратить с помощью генетического консультирования и пренатальной диагностики.

Структурные хромосомные аномалии

Табл. 10—13 служат общим руководством по наиболее распространенным хромосомным аномалиям у детей, рожденных живыми. В этих таблицах числа 1—22 обозначают порядковый номер хромосомы, р — короткое плечо хромосомы, q — длинное плечо; (+) или (—) после числа или буквы относятся соответственно к трисомии или утрате хромосомы или ее сегмента. Числа, стоящие после знаков р или q, означают хромосомные полосы. В некоторых из приведенных в таблицах синдромах частичной делении или частичной трисомии данные в пользу того, что указанное состояние имеет статус синдрома, сомнительны, т. к. основаны на небольшом числе наблюдений. Многие более редкие несбалансированные перестройки в таблицы не вошли.

Синдромы аутосомной трисомии

С выявлением большого количества новых хромосомных аномалий стало ясно, что многие влияния на фенотип неспецифичны и накладываются друг на друга. Таким образом, следует рассматривать не специфическое влияние на фенотип у данного пациента, а совокупность полученных данных. Однако при большинстве хромосомных дефектов фенотипические данные обычно достаточно характерны, и применение своеобразного «ключа» из наиболее распространенных индивидуальных аномалий представляет ценность для дифференциальной диагностики.

Синдромы частичной аутосомной трисомии

Аномалии половых хромосом

Ломкие участки и умственная отсталость, сцепленная с Х-хромосомой

Недавно в культурах лимфоцитов периферической крови умственно отсталых мужчин было обнаружено значительное количество случаев наличия ломких участков на дистальном сегменте длинного плеча Х-хромосомы (до 2% умственно отсталых мужчин, находящихся в специализированных лечебных учреждениях).

Стало ясно, что во многих семьях с умственно отсталыми сыновьями у последних имеются эти ломкие участки на Х-хромосоме, облигатным носителем которых является мать. Обширный анализ родословных подтвердил, что теоретический шанс рождения больного ребенка у такой матери равен 1:2, но на практике эта вероятность гораздо выше.



Стало также ясно, что этот ломкий участок Х-хромосомы при соответствующих условиях культивирования может быть выявлен в культуре фибробластов. Это означает, что в ближайшем будущем появится возможность пренатальной диагностики этого нарушения.

В настоящее время еще не уточнены причинно-следственные отношения между наличием такого участка и умственной отсталостью. Однако этому состоянию присвоен статус синдрома со следующими фенотипическими чертами у больных мужского пола: умственная отсталость, макроорхизм — объем более 25 мл на орхиметре, характерный внешний вид (крупные уши, большое лицо).

Заключение

Новые методы исследования хромосом способствовали повышению точности определения их аномалий, в результате чего выявлено большое число новых, ранее неизвестных изменений. Специфические мелкие изменения теперь часто связывают с определенными синдромами умственной отсталости и врожденных аномалий развития или со злокачественным заболеванием. Даже такие аспекты хромосомной функции, как аномальная репарация ДНК, подверженность действию повреждающих факторов, репликация последовательности ДНК, и участки неактивного гетерохроматина и активно-транскрибирующей рибосомной ДНК теперь можно изучать цитологическими методами. Научные исследования будущего в конечном итоге дадут возможность локализации пробного материала к высокоспецифичным мелким участкам на «распухших» хромосомах. Это позволит с точностью установить «точки разрыва» при хромосомных аномалиях или синдромах, а также поможет определить местоположение конкретных генов на цитологической карте.

Пренатальная диагностика внутриутробной инфекции

Диагностировать пренатально внутриутробную инфекцию плода можно только при некоторых заболеваниях. В большинстве случаев инфекционных заболеваний плода диагноз зависит от клинической, микробиологической или серологической диагностики инфекции у матери. Риск для плода часто можно прогнозировать на основании прошлого опыта; если риск представляется неприемлемо высоким, принимается решение о прерывании беременности. В других случаях повлиять на исход беременности почти невозможно и подтверждение диагноза внутриутробной инфекции откладывается до рождения ребенка. Однако в некоторых случаях дальнейшее исследование все же дает ценную информацию.

Краснуха

При заболевании краснухой в ранние сроки беременности риск заражения плода и развития у него тяжелых аномалий настолько высок, что делает оправданным прерывание беременности. В том случае, когда беременная приходит на прием к врачу через некоторое время после предполагаемого заражения краснухой или после тесного контакта с больным, подтверждение диагноза только методами серологического исследования может оказаться невозможным. В этом случае помогает амниоцентез и посев клеток амниотической жидкости на вирус краснухи. Выделение вируса подтверждает наличие у матери заболевания, которое по меньшей мере затронуло плаценту. Это еще не является доказательством инфицирования или аномалий развития плода, но риск и того и другого можно прогнозировать с достаточной точностью, если известно, на каком сроке беременности заболела мать. При заражении краснухой в конце I — начале II триместра риск развития аномалии плода относительно невелик, и принять решение, прерывать ли такую беременность, если это еще возможно, гораздо труднее. Выделение вируса краснухи из амниотической жидкости позволяет более точно прогнозировать риск для плода. К сожалению, вирус краснухи часто проходит 2—3-недельный инкубационный период перед тем, как его рост в культуре клеток становится очевидным (хотя иногда он растет и быстрее). Эта задержка осложняет ситуацию при сравнительно больших сроках беременности. Могут возникнуть затруднения и с выделением вируса, так что отрицательный результат не всегда исключает вероятность внутриутробной инфекции и аномалии развития плода. По этим причинам вопрос о проведении амниоцентеза должен решаться совместно с врачом-микробиологом или инфекционистом. Очень важно перед амниоцентезом заранее договориться с лабораторией о том, чтобы взятые пробы сразу попали в оптимальные условия.

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВ)

Во время беременности диагноз первичной инфекции ЦМВ ставится редко. Если заражение имело место, вероятность поражения плода достигает 50%. Тяжесть поражения зависит от срока беременности, при котором произошло заражение. При ранних сроках возможность заражения плода можно определить с помощью амниоцентеза. Выделение ЦМВ из амниотической жидкости хорошо коррелирует с инфекцией плода, но не помогает прогнозировать степень тяжести его поражения.

Хориоамнионит

Внутриутробная бактериальная инфекция в поздние сроки беременности может вызвать преждевременное излитие вод и преждевременные роды или осложнить их течение. Клинические признаки наличия инфекции у матери часто отсутствуют. При амниоцентезе (а его не всегда возможно произвести при излитии околоплодных вод) ценную информацию для определения тактики ведения беременных могут дать окрашивание по Граму и посев амниотической жидкости на аэробные и анаэробные бактерии и генитальные микоплазмы, а также определение величины отношения Л/С. В случае выявления бактериальной флоры при окрашивании или в культуре риск перинатального инфицирования ребенка очень высок (так же как и риск послеродового инфицирования матери), поэтому рекомендуется не откладывать родоразрешение.